Osteoblastos são células fundamentais para formação e reparo do tecido ósseo e o processo de diferenciação osteoblástica é regulado pelo fator de transcrição relacionado à runt 2 (Runx2), além de inúmeras outras proteínas que atuam sobre vias de sinalização celular. Resultados do nosso grupo de pesquisa mostraram que a proteína da matriz extracelular agrin é expressa por células-tronco mesenquimais (MSCs) e osteoblastos e que essa proteína favorece a diferenciação osteoblástica de MSCs derivadas da medula óssea. No entanto, até o momento, não há dados na literatura acerca da participação de agrin na diferenciação osteoblástica de MSCs derivadas do tecido adiposo. Portanto, o objetivo desse estudo é investigar a participação de agrin sintetizada por células que expressam Runx2 na diferenciação osteoblástica de MSCs derivadas do tecido adiposo, utilizando camundongos transgênicos. Para isso, MSCs serão obtidas do tecido adiposo inguinal de camundongos Runx2- Cre;Agrinfl/fl (deleção de agrin) e Agrinfl/fl (controle) e serão cultivadas em condições osteogênicas por até 21 dias. Serão avaliadas: (1) a proliferação celular por contagem do número de células e (2) a expressão gênica de agrin e seus receptores, e de marcadores ósseos por PCR em tempo real, aos 3, 7 e 10 dias, (3) a atividade de fosfatase alcalina por marcação com Fast red, aos 10 dias e (4) a formação de matriz extracelular mineralizada por coloração com vermelho de Alizarina, aos 21 dias. Os dados serão submetidos ao teste de aderência à curva normal e homogeneidade de variâncias para determinar a análise estatística adequada. O nível de significância será de 5% (p d 0.05). Como agrin é ainda pouco explorada no contexto da biologia óssea, os resultados obtidos com o desenvolvimento desse projeto serão relevantes, uma vez que agrin pode ser uma proteína alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que favoreçam formação e regeneração óssea, regulando eventos relacionados à diferenciação osteoblástica.

O secretoma contido no meio condicionado por células-tronco mesenquimais (MSCs) modificadas geneticamente para superexpressar proteína óssea morfogenética 9 (BMP-9) (MSCsBMP-9) favorece o reparo de defeitos ósseos criados em calvárias de camundongos. Como superfícies tridimensionalmente impressas na escala microtopográfica aumentam a diferenciação osteoblástica de MSCs, estabelecemos a hipótese de que o secretoma de MSCsBMP-9 cultivadas sobre uma superfície com microtopografia induz maior reparo ósseo do que o secretoma de MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície lisa. Assim, o objetivo desse estudo é Investigar o efeito do secretoma contido no meio condicionado por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície com microtopografia no reparo ósseo de defeitos criados em calvárias de ratos. Os meios condicionados por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície lisa ou com microtopografia serão coletados ao final de 4 horas. Defeitos de 5 mm de diâmetro serão criados em calvárias de ratos que serão distribuídos em grupos experimentais (n = 12 por grupo) de acordo com os seguintes tratamentos feitos por injeção local de: (1) meio não condicionado, (2) meio condicionado por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície lisa e (3) meio condicionado por MSCsBMP-9 cultivadas sobre superfície com microtopografia. Os tratamentos serão realizados 2 semanas após a criação dos defeitos e, 4 semanas após o tratamento, o tecido ósseo formado será analisado por microtomografia computadorizada e cortes histológicos. Os dados quantitativos serão submetidos ao teste de aderência à curva normal para determinar o teste estatístico adequado a ser aplicado.

As células derivadas do ligamento periodontal (PDLCs) possuem característica de células mesenquimais e, de acordo com a literatura, há uma heterogeneidade na capacidade de formação de matriz mineralizada extracelular. Porém, estudos publicados do nosso grupo de pesquisa apontam que essa heterogeneidade está relacionada ao perfil epigenético e transcricional distintos, o que pode pré- determinar um dado fenótipo celular. Portanto, os perfis epigenético e transcricional estão fortemente relacionados à aquisição de um fenótipo osteoblástico específico. Os RNAs longos não codificantes (lncRNA), participam da regulação epigenética pela ligação a proteínas regulatórias da cromatina e podem estar envolvidos na modulação de genes osteogênicos. O lncRNA MIR31HG foi escolhido como alvo deste projeto, a partir de análises de bioinformática de dados epigenômicos gerados no último Auxílio (FAPESP/Universidade de Birmingham, UK 2017/07944-5) e nossa hipótese é que ele esteja associado à capacidade reduzida de formação de matriz mineral. Dessa forma, o papel do lncRNA MIR31HG será investigado na regulação epigenética em PDLCs com baixa capacidade de produzir matriz mineral, imortalizadas e editadas por Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/associated nuclease Cas9 (CRISPR-Cas9). O efeito do silenciamento do lncRNA MIR31HG será investigado na formação de matriz mineral in vitro e na relação com o complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2), na marca epigenética H3K27me3 e em marcadores osteogênicos, por imunoprecipitação de cromatina, seguida de sequenciamento (ChIP-seq) e níveis proteicos (WB ou MagPix). Os mecanismos epigenéticos são plásticos e reversíveis, podendo ser alternativas promissoras para terapias baseadas em células ou biomoléculas funcionalizando superfícies de implantes ou biomateriais, para o tratamento de diversos defeitos ósseos. (AU)

Existem evidências de que condicionamentos de células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentam sua eficácia nos procedimentos de medicina regenerativa. Estudos têm demonstrado que o emprego isolado de diferentes estratégias estimula a diferenciação celular e, em última análise, a formação tecidual. Entre elas, o aumento da expressão ou da exposição de MSCs a fatores de crescimento, modificações da superfície de cultivo e a terapia com fotobiomodulação (FBM). Nesse sentido, nossa hipótese é que a combinação desses estímulos resulta em efeito sinérgico sobre MSCs, capazes de regenerar o tecido ósseo. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar o efeito da terapia utilizando injeção local de MSCs triplamente condicionadas por (1) edição gênica para sobre-expressar BMP-9, (2) cultivo sobre superfícies com microtopografia e (3) FBM com laser sobre a regeneração óssea. Para isso, uma linhagem imortalizada de MSCs derivadas de medula óssea serão geneticamente editadas para sobre-expressar BMP-9 (MSCsBMP-9+) pelo sistema CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein 9). MSCsBMP-9+ cultivadas sobre superfícies com microtopografia serão avaliadas pela expressão proteica de BMP-9, expressão de genes da via das BMPs e da diferenciação osteoblástica. Essas células serão injetadas na concentração de 5´104 células/50 mL de PBS em defeitos de calvária de ratos criados 2 semanas antes da injeção. A FBM será aplicada imediatamente, 48 e 96 h após a injeção (808 nm; 40 mW; 1,42 W/cm2; 4 J/cm2; 3 s; 0,12 J/ponto; 0,028 cm2) e em quatro pontos (um no centro e três equidistantes, ao redor do defeito). A formação óssea será avaliada por microtomografia computadorizada in vivo imediatamente, 2 e 4 semanas após a injeção e por análise histológica ao final de 4 semanas. Os dados quantitativos serão avaliados quanto à aderência à curva normal e homogeneidade de variâncias para selecionar os testes estatísticos adequados (nível de significância de 5%). Os resultados desse estudo poderão contribuir para o estabelecimento de novos tratamentos, baseados em conceitos de terapia celular, para promover a regeneração óssea em sítios desafiadores, com aplicações nas áreas de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, Periodontia, Implantodontia e Ortopedia.

O câncer de ovário (CO) é a quinta maior causa de mortes por câncer entre as mulheres e a neoplasia ginecológica mais letal, dado sua detecção tardia, recorrência e metástase. Evidências sugerem que o microambiente tumoral das neoplasias é composto por populações heterogêneas de células com diferentes níveis de malignidade e que o desenvolvimento do tumor é impulsionado por um subconjunto de células especializadas, caracterizadas pelas propriedades de auto-renovação e multipotência, designadas como células-tronco cancerosas (CTC). As CTC podem se originar de células-tronco mesenquimais (CTM), tais como as derivadas de tecido adiposo humano (CTM-TAh), que estão sujeitas a diferenciação maligna para CTC ou fibroblastos associados ao câncer (FACs) a partir de fatores secretados pelas células cancerosas, principalmente através de exossomos, o que propicia uma forma mais agressiva e quimioresistente de CO contra as terapias convencionais. Recentemente tem sido demonstrado que a melatonina, um hormônio secretado pela glândula pineal, pode atuar como uma potencial terapia contra o câncer devido as suas funções antioxidantes, imunomodulatórias, antiangiogênicas e pró-apoptóticas, suprimindo a atividade de FACs e CTC. Além disso, o uso do meio de cultura condicionado (MC) e dos exossomos de CTM-TAh tratadas com Paclitaxel (PTX) já se mostrou efetivo na inibição de células cancerosas em estudos in vitro e in vivo de diferentes tumores. Portanto, o presente estudo objetiva avaliar o potencial da melatonina na diferenciação neoplásica de CTM-TAh mediada por células cancerosas de ovário (SKOV-3 e CAISMOV24) e a utilização terapêutica de CTM-TAh tratadas com melatonina e seus exossomos derivados na progressão tumoral. Para isso, serão conduzidos estudos in vitro com diferentes metodologias que permitirão inicialmente observar o efeito do MC proveniente de cada linhagem celular sobre a outra, acompanhado ou não dos tratamentos com melatonina e PTX, avaliados em sistema de cultivo independente ou em uma co-cultura indireta. A seguir, as células de CO serão semeadas em um sistema de cultivo não aderente para avaliação da formação e tratamento dos esferoides tumorais multicelulares (ETM) por CTM-TAh tratadas com melatonina e PTX ou seu MC derivado. Por fim, as CTM-TAh serão tratadas com melatonina ou PTX, seu MC será obtido e os exossomos isolados serão administrados em ensaio de drug-delivery in vivo utilizando camundongos BALB/c-nude induzidos ao CO com células SKOV-3. O estudo ainda contará com avaliações de viabilidade, citotoxicidade, migração, invasão e apoptose, além de ensaios para imunomarcação e quantificação proteica de marcadores para diferenciação em CTC e FACs de cada linhagem celular frente aos tratamentos específicos. Adiante serão quantificadas proteínas-alvo no MC das culturas celulares por ensaio multiplex. Os exossomos serão submetidos à microscopia eletrônica de transmissão (MET) para caracterização ultraestrutural, seguido da análise de seu conteúdo por espectrometria de massas com análise ontológica para obtenção dos perfis proteômicos. A partir destas análises pretende-se qualificar as propriedades terapêuticas da melatonina sobre as células cancerosas de ovário e sua capacidade adjuvante com as CTM-TAh em contribuir para elucidar o entendimento acerca do papel das CTM-TAh sobre a inibição ou progressão do carcinoma ovariano. Ao final, o estudo almeja estabelecer uma metodologia de tratamento drug-delivery com a associação de CTM-TAh e melatonina que seja útil na inibição do desenvolvimento tumoral.

A obtenção do meio de cultura condicionado (MC) da cultura de células-tronco se dá a coleta do secretoma dascélulas durante o processo de cultura celular, sendo um meio com fatores de crescimento, citocinas e moléculassinalizadoras livres e vesículas extracelulares, que progressivamente se tornam relevante, tanto para diagnósticocomo para terapêutica. Neste campo, identificamos a Síndrome do Olho Seco (SOS) que impacta profundamente aqualidade de vida das pessoas. O Laboratório de Biologia Celular tem desenvolvido como produto para essespacientes o autocolírio de soro de sangue, porém existem pacientes com impossibilidade de acesso venoso, ou comsorologias reagentes para doenças infecciosas que são impedidos de utilizar o produto. Diante disto, o projeto tempor objetivo produzir soro alogênico ABO de tipagem sanguínea compatível e não compatível com doador de célulatronco límbica e MC a partir do cultivo de células-tronco obtidas de cordão umbilical (CTMcup), célula-tronco detecido adiposo (CTMTA) e célula-tronco límbica (CTL) com intuito de se obter o secretoma das células paraavaliação terapêutica na SOS. As célulastronco serão cultivadas em meio DMEM aditivado e com 10% de soro fetalbovino para caracterização imunofenotípica por citometria de fluxo com marcadores específicos. As células serãocultivadas até que atinjam 70% de confluência, momento em que sofrerão wash out, uma etapa de lavagem para aretirada do soro fetal bovino (SFB) e receberão o meio DMEM aditivado xeno free por 48 horas. Após esse período,o secretoma será coletado, centrifugado e armazenado. As CTL serão cultivadas em placas de poços para oprocedimento da técnica wound healing (WH) com cada colírio biológico produzido. A primeira coluna equivale aocontrole e a segunda e terceira coluna, as células sofrerão estresse osmótico para a simulação da SOS com meiohiperosmolar (MH) (420 mOsm/L) por 48 horas. Posteriormente, será realizada a técnica WH, fazendo uma lesãonos três poços que receberão diferentes condicionamentos. A primeira coluna receberá o meio de cultura padrão,segunda coluna somente MH e a terceira receberá 50% MH e 50% colírio biológico. Os poços serão observados atéo fechamento da ferida e o resultado analisado com uso do software livre ImageJ com cálculo das áreas

A degeneração Walleriana (DW) é um processo de degradação de restos de mielina e axônios mortos após um trauma mecânico, desordens metabólicas e/ou imunes no sistema nervoso periférico, sendo importante para a recuperação funcional do tecido dias depois. A citocina IL-33 é pertencente ao grupo da superfamília da IL-1, ela é expressa por células não hematopoiéticas e já foi descrita sendo importante em diferentes tecidos. Em relação ao sistema nervoso, a IL-33 foi descrita sendo importante para a regeneração da medula espinal após lesão. Contudo, ainda não havia relatos da presença de IL-33 ou mecanismo que ela participasse no sistema nervoso periférico, até mesmo nota-se uma lacuna de informações sobre o envolvimento da IL-33 durante a DW. Nosso grupo demonstrou a presença de IL-33 associado ao local da lesão no nervo ciático e conseguimos elucidar a fonte celular de IL-33 no nervo ciático, oriundas de células mesenquimais. Diante destes achados, nossa hipótese é que no processo de DW, a IL-33 desempenha uma função importante no recrutamento dos leucócitos, sendo o principal alvo as células mesenquimais e também ativa células imunes via receptor ST2 aumentado o processo degenerativo. Para isso utilizaremos animais deficientes para a IL-33 ou para o seu receptor ST2 e induziremos o modelo de esmagamento do nervo ciático (CNI), avaliaremos o índice de funcionalidade do ciático (SFI); equilíbrio/capacidade locomotora com Rotarod; sensação dolorosa com testes mecânicos e térmicos. Além disso, utilizaremos técnicas histológicas para observar a organização do tecido, remielinização, após CNI e citometria de fluxo em diferentes dias para caracterizar o infiltrado de células no sitio inflamatório no nervo ciático. Uma vez que o receptor ST2 está presente em várias células imunes, iremos caracterizar se macrófagos residentes, expressam o receptor ST2 durante o CNI, e então investigaremos se a IL-33 é importante para ativação dessas células. E por fim, avaliaremos a presença de IL-33 em transcritos de amostras humanas com a finalidade de validar se os mecanismos que serão observados nos modelos animais ocorrem também em amostras de humanos.

Recessão gengival é uma condição caracterizada pela exposição oral da superfície da raiz devido a um deslocamento da margem gengival apical à junção cemento-esmalte. As consequências mais comuns da recessão gengival são a deterioração da estética dentária, bem como a hipersensibilidade da dentina e até mesmo a perda do dente. Atualmente, um dos procedimentos mais utilizados para o recobrimento radicular é o que é utilizado enxerto do tecido conjuntivo mais retalho posicionado coronalmente (CTG + CAF). Porém, cirurgias que envolvem a coleta de enxerto são demoradas e podem ter uma alta morbidade, devido à necessidade de um segundo local cirúrgico, além de aumentar o desconforto do paciente, sangramento pós-cirúrgico e suprimento limitado de tecido doador. Por esses motivos, são propostas técnicas cirúrgicas alternativas ao CTG + CAF e também o uso de alguns produtos para obter redução das recessões gengivais. Diferente de todos os produtos encontrados no mercado, desenvolvemos um bioenxerto baseado em terapia celular que é composto por um scaffold de ácido hialurônico (AH) e que contém células mesenquimais (CM) incorporadas. Essa biotinta é bioimpressa em uma bioimpressora 3D o que confere escalonabilidade a produção que é totalmente baseada em conceito GMP (Good Manufacturing Practice). Durante a primeira fase de desenvolvimento do bioenxerto foi estabelecido o protocolo de obtenção do biomaterial a base de AH que apresentou textura e condições de bioimpressão e de manuseio. Assim que foram determinadas as condições do biomaterial, foi demonstrado que esse scaffold e o processo de bioimpressão não prejudicam a viabilidade das CMs contidas. Além disso, foi verificado in vitro que o bioenxerto não é citotóxico para células pertencentes a mucosa oral como os queratinócitos gengivais e que promove a proliferação de fibroblastos gengivais humanos (FGH) de maneira dose dependente, sendo, portanto, o bioenxerto com 1,5x105 CMs o que possui maior capacidade de estimular a multiplicação dos FGHs. Somado ao efeito proliferativo do bioenxerto, verificamos in vitro que este produto também é capaz de promover maior migração de FGH. Uma vez que a quantidade de CMs para a obtenção dos resultados biológicos foi determinada e que propriedades biológicas favoráveis foram demonstradas durante a prova de conceito, estudos posteriores são necessários para que seja verificado o efeito terapêutico dos bioenxertos no tratamento de modelos de recessão gengival in vivo, focando as análises nos parâmetros exigidos pela ANVISA para a liberação dos testes em humanos futuramente. Além disso, também objetivando a entrada deste produto no mercado é necessário estabelecer as condições adequadas para armazenamento e transporte dos bioenxertos para que os mesmos sejam configurados como produtos viáveis. (AU)

A terapia celular é uma das estratégias da Medicina Regenerativa que se mostra promissora para o tratamento de defeitos ósseos extensos utilizando, principalmente, células-tronco mesenquimais (MSCs, abreviação do Inglês, Mesenchymal Stem Cells) e o estudo de moléculas que atuam nessas células para favorecer a regeneração óssea é relevante nesse contexto. Dentre essas moléculas, a proteína de matriz extracelular agrin, envolvida em vários processos biológicos, foi detectada em condrócitos e demonstrada sua participação no desenvolvimento do sistema esquelético. No entanto, até o momento, há pouca informação na literatura acerca dos efeitos de agrin na diferenciação osteoblástica de MSCs e na formação óssea por elas induzida, assim como das vias de sinalização celular envolvidas nesses efeitos. Portanto, os objetivos desse estudo são investigar: (1) in vitro o efeito da sobre-expressão e do silenciamento de agrin por CRISPR/Cas9 sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs; (2) in vitro a participação das vias de sinalização de BMPs, Wnt, Notch e Hippo-Yap/Taz no efeito de agrin sobre a diferenciação osteoblástica de MSCs e (3) in vivo o efeito de MSCs com sobre-expressão e silenciamento de agrin por CRISPR/Cas9 sobre a regeneração do tecido ósseo em defeitos criados em calvárias de camundongos. Os resultados desse estudo poderão gerar dados importantes acerca da função de agrin no tecido ósseo e, possivelmente, para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas em situações clínicas que envolvem a regeneração óssea. (AU)